Kỹ Thuật Pha Loãng Nối Tiếp Trong Nuôi Cấy Vi Sinh

Pha loãng nối tiếp (Serial Dilution) là kỹ thuật pha loãng tuần tự được thực hiện để chuyển đổi dung dịch đậm đặc thành nồng độ loãng hơn.

Nói một cách đơn giản, pha loãng nối tiếp là quá trình pha loãng từng bước dung dịch với hệ số pha loãng tương ứng.

Trong Sinh học, pha loãng nối tiếp thường liên quan đến việc giảm mật độ tế bào trong môi trường nuôi cấy để đơn giản hóa hoạt động.

Mục tiêu của pha loãng nối tiếp

Mục tiêu của phương pháp pha loãng nối tiếp là ước tính nồng độ (số lượng sinh vật, vi khuẩn, virus hoặc khuẩn lạc) của một mẫu chưa biết bằng cách liệt kê số lượng khuẩn lạc được nuôi cấy từ các độ pha loãng nối tiếp của mẫu.

Trong quá trình pha loãng nối tiếp, mật độ tế bào được giảm trong mỗi bước để dễ dàng tính toán nồng độ của tế bào trong dung dịch ban đầu bằng cách tính tổng độ pha loãng trong toàn bộ chuỗi.

Pha loãng nối tiếp thường được thực hiện để tránh phải hút một lượng thể tích rất nhỏ (1-10 µl) để pha loãng dung dịch.

Bằng cách pha loãng mẫu theo cách có kiểm soát, có thể thu được các đĩa nuôi cấy đã ủ với số lượng khuẩn lạc có thể đếm được dễ dàng (khoảng 20–100) và tính toán số lượng vi khuẩn có trong mẫu.

Công thức pha loãng nối tiếp

Pha loãng nối tiếp liên quan đến quá trình lấy mẫu và pha loãng mẫu qua một loạt thể tích tiêu chuẩn của chất pha loãng vô trùng, có thể là nước cất hoặc nước muối 0,9%.

Sau đó, một thể tích đo được nhỏ của mỗi độ pha loãng sẽ được sử dụng để cấy trải lên đĩa petri chứa môi trường thạch.

Tùy thuộc vào nồng độ ước tính của các tế bào/sinh vật trong một mẫu, mức độ pha loãng được xác định. Ví dụ: nếu một mẫu nước được lấy từ môi trường cực kỳ ô nhiễm, thì hệ số pha loãng sẽ tăng lên. Ngược lại, đối với mẫu ít bị nhiễm bẩn hơn, hệ số pha loãng thấp có thể là đủ.

Pha loãng nối tiếp hai lần (two-fold) và mười lần (ten-fold) thường được sử dụng để chuẩn độ kháng thể hoặc chuẩn bị các chất phân tích đã pha loãng trong phòng thí nghiệm.

Hệ số pha loãng trong độ pha loãng nối tiếp có thể được xác định cho một ống nghiệm riêng lẻ hoặc có thể được tính là hệ số pha loãng tổng trong toàn bộ dãy.

Hệ số pha loãng của mỗi ống trong chuỗi pha loãng được tính bằng công thức:

Đối với độ pha loãng gấp 10 lần, 1 ml mẫu được thêm vào 9 ml chất pha loãng. Trong trường hợp này, hệ số pha loãng của ống nghiệm đó sẽ là:

Sau ống thứ nhất, mỗi ống là dung dịch pha loãng của ống pha loãng trước.

Bây giờ, đối với tổng hệ số pha loãng:

Tổng hệ số pha loãng của ống thứ hai = độ pha loãng của ống thứ nhất × độ pha loãng của ống thứ hai.

Ví dụ:

Đối với ống đầu tiên, hệ số pha loãng = 10^-1 (1 ml được thêm vào 9 ml)

Đối với ống thứ 2, hệ số pha loãng = 10^-1 (1ml cho vào 9ml)

Tổng hệ số pha loãng = độ pha loãng trước × độ pha loãng của ống tiếp theo

= tổng độ pha loãng 10^-1 × 10^-1 = 10^-2

Quá trình pha loãng nối tiếp

Sau đây là quy trình pha loãng mẫu gấp mười lần đến hệ số pha loãng 10^-6:

Mẫu/môi trường được chuẩn bị trong 1 bình tam giác và 6 ống nghiệm, mỗi ống chứa 9 ml chất pha loãng vô trùng, có thể là nước cất hoặc nước muối 0,9%.
Chuẩn bị pipet vô trùng.
Dùng pipet hút 1ml dịch mẫu/môi trường từ bình tam giác.
Sau đó, mẫu được thêm vào ống đầu tiên để tạo thành tổng thể tích 10 ml. Điều này cung cấp độ pha loãng ban đầu là 10^-1.
Dung dịch pha loãng ở ống đầu tiên được trộn kỹ bằng cách dùng pipet hút lên và xuống nhiều lần.
Loại bỏ đầu pipet vừa dùng và thay thế một đầu pipet mới được gắn vào pipet.
Bây giờ, 1 ml hỗn hợp được lấy từ độ pha loãng 10^-1 và được đổ vào ống thứ hai. Ống thứ hai lúc này có tổng hệ số pha loãng là 10^-2.
Quá trình tương tự sau đó được lặp lại cho các ống còn lại, lấy 1 ml từ ống trước đó và thêm vào 9 ml dung dịch pha loãng tiếp theo.
Khi 6 ống nghiệm được sử dụng, độ pha loãng cuối cùng cho vi khuẩn/tế bào sẽ là 10^-6 (1/1.000.000).

Ứng dụng của kỹ thuật pha loãng nối tiếp

Pha loãng nối tiếp được thực hiện trong một số ngành khoa học thực nghiệm như Vi sinh vật, Hóa Sinh, Dược Lý, Vật lý và Vi lượng đồng căn (homeopathy):

Pha loãng nối tiếp được sử dụng trong Vi sinh vật để ước tính nồng độ hoặc số lượng tế bào/sinh vật trong mẫu để thu được đĩa đã ủ với số lượng khuẩn lạc dễ dàng đếm được.
Trong hóa sinh, pha loãng nối tiếp được sử dụng để thu được nồng độ thuốc thử và hóa chất mong muốn từ nồng độ cao hơn. Hoặc pha loãng axit và bazơ trong hóa học để thu được nồng độ cần thiết.
Trong các phòng thí nghiệm dược phẩm, pha loãng nối tiếp được thực hiện để nhận được nồng độ hóa chất và hợp chất cần thiết, vì phương pháp này hiệu quả hơn so với pha loãng riêng lẻ.
Trong vi lượng đồng căn, pha loãng vi lượng đồng căn được sử dụng khi một chất được pha loãng trong nước cất hoặc rượu. Người ta tin rằng pha loãng làm tăng hiệu lực của chất pha loãng bằng cách kích hoạt năng lượng quan trọng của nó.

Hạn chế của kỹ thuật pha loãng nối tiếp

Mặc dù pha loãng nối tiếp là một kỹ thuật hữu ích trong phòng thí nghiệm, nhưng nó vẫn gặp phải một số thách thức. Một số trong số đó là:

Một lỗi có thể xảy ra trong quá trình hút dung dịch pha loãng mẫu và sự không chính xác của quá trình pha loãng sẽ dẫn tới quá trình pha loãng kém chính xác hơn. Điều này dẫn đến độ pha loãng cao nhất có độ chính xác thấp nhất.
Vì quá trình pha loãng nối tiếp được thực hiện theo cách từng bước, do đó đòi hỏi một khoảng thời gian dài hơn, điều này làm hạn chế hiệu quả của phương pháp.
Pha loãng nối tiếp chỉ cho phép giảm số lượng vi khuẩn/tế bào chứ không thể phân tách tách vi khuẩn/tế bào như trong các kỹ thuật khác như dòng chảy tế bào (Flow Cytometry).
Kỹ thuật này cũng đòi hỏi có kiến thức chuyên sâu về Công nghệ sinh học Vi sinh vật và kiến thức về kỹ thuật vô trùng.

Lời kết: như vậy, thông qua bài viết tổng quan này, các bạn đã có được những kiến thức tổng quan về kỹ thuật pha loãng nối tiếp. Đây là một kỹ thuật quan trọng không chỉ trong lĩnh vực Vi sinh vật mà còn được ứng dụng trong nhiều ngành nghề khác.

Tài liệu tham khảo

Basic Practical Microbiology – A Manual. Microbiology Society.

Phần mềm tính toán pha loãng nối tiếp

(*) Theo MicroNotes

Xem thêm

Tổng quan môi trường nuôi cấy vi sinh vật
Môi trường PDA
Môi trường LB