Quy trình lên men Bacillus subtilis

Bacillus subtilis là một trong những loài vi khuẩn được sử dụng rộng rãi nhất trong công nghệ sinh học vi sinh vật. Trong phòng thí nghiệm, nó là mô hình kinh điển để nghiên cứu sinh lý vi khuẩn Gram dương, tiết protein ngoại bào, điều hòa gen và hình thành bào tử. Trong sản xuất, nó lại là “nhà máy tế bào” quen thuộc để tạo enzyme, peptide kháng khuẩn, chất chuyển hóa thứ cấp, chế phẩm probiotic, chế phẩm nông nghiệp và chế phẩm xử lý môi trường.

Điểm làm cho Bacillus subtilis đặc biệt hấp dẫn là khả năng sinh trưởng nhanh, thích nghi tốt, tiết enzyme mạnh và có thể tạo bào tử nội sinh. Bào tử giúp vi khuẩn chịu được nhiệt, khô, áp suất thẩm thấu và nhiều điều kiện bất lợi khác. Đây là lợi thế lớn nếu sản phẩm cuối là dạng bột, dạng hạt hoặc chế phẩm cần bảo quản dài ngày. Nhưng trong một số sản phẩm dạng dung dịch, đặc biệt là men vi sinh cần tế bào sinh dưỡng hoạt động nhanh, tạo bào tử quá sớm lại có thể là vấn đề cần kiểm soát.

Vì vậy, khi nói đến quy trình lên men Bacillus subtilis, không thể chỉ nói chung chung là “nuôi vi khuẩn trong môi trường dinh dưỡng”. Quy trình đúng phải bắt đầu từ mục tiêu sản phẩm: cần sinh khối sống hay enzyme? Cần bào tử hay không bào tử? Sản phẩm dùng cho người, vật nuôi, cây trồng hay xử lý môi trường? Mỗi mục tiêu sẽ kéo theo chiến lược chọn giống, môi trường, pH, oxy hòa tan, thời điểm thu hoạch và tiêu chuẩn kiểm nghiệm khác nhau.

Về mặt khoa học, Bacillus subtilis được mô tả là vi khuẩn Gram dương hiếu khí, có năng lực tiết protein tốt và được sử dụng rộng rãi như một nền tảng sản xuất enzyme, hóa chất sinh học, peptide kháng khuẩn và các ứng dụng nông nghiệp, y sinh. Các tổng quan gần đây cũng xem B. subtilis là một “cell factory” quan trọng trong công nghiệp vi sinh nhờ nền tảng di truyền rõ, khả năng sinh trưởng tốt và hệ thống tiết protein hiệu quả.

1. Bacillus subtilis là gì? và vì sao phù hợp cho lên men công nghiệp?

Bacillus subtilis là vi khuẩn Gram dương, hình que, thường gặp trong đất, vùng rễ cây, thực phẩm lên men và nhiều môi trường tự nhiên khác. Đây là loài vi khuẩn có khả năng tạo bào tử nội sinh, nghĩa là khi điều kiện môi trường bất lợi, tế bào có thể chuyển sang trạng thái bào tử để tồn tại lâu dài.

Trong công nghệ vi sinh, Bacillus subtilis được quan tâm vì 5 lý do chính:

Thứ nhất, nó sinh trưởng nhanh trong điều kiện hiếu khí. Thời gian lên men thường ngắn hơn nhiều so với một số hệ vi sinh khác, giúp giảm chi phí vận hành và tăng hiệu suất thiết bị.

Thứ hai, nó có khả năng tiết enzyme ngoại bào mạnh. Nhiều enzyme công nghiệp như protease, amylase, xylanase, cellulase, lipase hoặc pectinase có thể được sản xuất từ các chủng Bacillus. Đây là lý do nhóm vi khuẩn này được ứng dụng rộng trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, xử lý chất hữu cơ, chất tẩy rửa, công nghiệp lên men và nông nghiệp.

Thứ ba, Bacillus subtilis có thể tạo bào tử. Bào tử là dạng tồn tại bền vững, phù hợp với sản phẩm cần bảo quản lâu, vận chuyển xa hoặc chịu điều kiện môi trường khắc nghiệt.

Thứ tư, nhiều chủng có khả năng tạo hợp chất đối kháng vi sinh vật gây hại. Trong nông nghiệp, Bacillus subtilis được nghiên cứu như một vi khuẩn vùng rễ có khả năng hỗ trợ sinh trưởng cây trồng, cạnh tranh với tác nhân gây bệnh, tạo siderophore, enzyme phân giải thành tế bào và lipopeptide kháng nấm.

Thứ năm, hệ gen và sinh lý của B. subtilis được nghiên cứu rất sâu. Điều này giúp người làm R&D dễ tối ưu chủng, tối ưu môi trường, kiểm soát tạo bào tử, tăng tiết enzyme hoặc định hướng sản phẩm theo yêu cầu. Tuy nhiên, tôi cho rằng có một hiểu lầm khá phổ biến: cứ là Bacillus subtilis thì sản xuất thế nào cũng được. Thực tế không phải vậy. Cùng là B. subtilis, nhưng mỗi chủng có năng lực sinh enzyme, tạo bào tử, tạo màng sinh học, chịu acid, chịu muối, chịu nhiệt và mức độ an toàn rất khác nhau. Với sản phẩm dùng trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi hoặc probiotic, đánh giá an toàn đến cấp độ chủng là bắt buộc về mặt khoa học.

Cơ quan quản lý an toàn thực phẩm châu Âu (EFSA) nêu rõ với vi sinh vật thuộc nhóm QPS, (Qualified presumption of safety) vẫn cần xác nhận định danh chủng, không mang gen kháng kháng sinh mắc phải có ý nghĩa lâm sàng và, riêng với Bacillus, cần chứng minh không có tiềm năng sinh độc tố.

2. Xác định mục tiêu trước khi xây dựng quy trình lên men

Một quy trình lên men Bacillus subtilis tốt không bắt đầu từ công thức môi trường. Nó bắt đầu từ câu hỏi: sản phẩm cuối cần gì?

Có ít nhất 4 hướng sản xuất chính.

2.1. Lên men thu sinh khối tế bào sống

Mục tiêu là đạt mật độ tế bào sống cao, thường dùng cho chế phẩm vi sinh dạng dung dịch, men vi sinh nông nghiệp, vi sinh xử lý môi trường hoặc nguyên liệu phối trộn. Trong trường hợp này, cần kiểm soát tốt pha sinh trưởng, hạn chế stress quá mức, tránh chết tế bào và tránh nhiễm tạp.

Nếu sản phẩm cần tế bào sinh dưỡng, quy trình phải thu hoạch sớm, thường ở cuối pha log hoặc đầu pha ổn định. Nếu để quá lâu, nguồn carbon, nitơ hoặc phosphate suy giảm, vi khuẩn sẽ dễ chuyển sang hướng tạo bào tử.

2.2. Lên men tạo bào tử

Mục tiêu là tạo tỷ lệ bào tử cao, thích hợp với chế phẩm dạng bột, dạng viên, dạng cốm, chế phẩm xử lý ao nuôi, phân bón vi sinh hoặc probiotic cần độ bền bảo quản cao.

Chiến lược ở đây khác hẳn. Giai đoạn đầu cần cho tế bào tăng sinh tốt. Giai đoạn sau phải tạo điều kiện “giới hạn dinh dưỡng có kiểm soát” để kích hoạt quá trình sporulation. Nói cách khác, muốn có nhiều bào tử không phải cứ “bỏ đói” là xong. Nếu stress quá mạnh, tế bào chết trước khi kịp tạo bào tử. Nếu dinh dưỡng quá giàu, tế bào lại kéo dài pha sinh dưỡng và tỷ lệ bào tử thấp.

Quá trình tạo bào tử ở Bacillus subtilis được xem là đáp ứng thích nghi với thiếu hụt dinh dưỡng, trong đó Spo0A là yếu tố điều hòa trung tâm khởi động chương trình phát triển tạo bào tử.

2.3. Lên men sản xuất enzyme ngoại bào

Nếu mục tiêu là protease, amylase, xylanase hoặc enzyme khác, quy trình cần tối ưu theo hoạt tính enzyme, không chỉ theo CFU. Khi đó, nguồn carbon, nguồn nitơ, tỷ lệ C/N, pH, nhiệt độ, oxy hòa tan và thời điểm thu dịch enzyme đều quan trọng.

Một lỗi khá hay gặp là đánh giá quy trình enzyme bằng mật độ tế bào. Mật độ tế bào cao chưa chắc enzyme cao. Có chủng tăng sinh rất mạnh nhưng tiết enzyme kém. Có quy trình sinh khối không quá cao nhưng enzyme ngoại bào lại đạt đỉnh ở thời điểm nhất định.

2.4. Lên men tạo chất chuyển hóa hoặc chất đối kháng

Một số chủng Bacillus subtilis có thể sinh lipopeptide, bacteriocin-like substance, siderophore, chất kích thích sinh trưởng hoặc hợp chất ức chế nấm bệnh. Với nhóm này, chiến lược lên men thường hướng đến pha ổn định hoặc điều kiện stress nhẹ, vì nhiều chất chuyển hóa thứ cấp không đạt đỉnh ở pha tăng trưởng nhanh.

3. Sơ đồ tổng quát quy trình lên men Bacillus subtilis

Một quy trình cơ bản thường gồm 8 bước:

1. Chọn và bảo quản chủng giống.
2. Hoạt hóa giống.
3. Nhân giống cấp 1.
4. Nhân giống cấp 2 hoặc seed fermenter.
5. Chuẩn bị môi trường lên men chính.
6. Vận hành lên men chính.
7. Thu hoạch sinh khối, dịch enzyme hoặc bào tử.
8. Kiểm nghiệm, ổn định và phối trộn thành phẩm.

Điều quan trọng là mỗi bước phải có chỉ tiêu kiểm soát. Không nên vận hành theo cảm tính. Ví dụ, bước hoạt hóa giống cần kiểm tra độ thuần, hình thái khuẩn lạc, thời gian sinh trưởng. Bước nhân giống cần kiểm tra OD, CFU, pH, nhiễm tạp. Bước lên men chính cần theo dõi pH, DO, nhiệt độ, bọt, tốc độ khuấy, mùi, độ nhớt, thời điểm chuyển pha và tỷ lệ bào tử.

Theo kinh nghiệm triển khai quy trình vi sinh, sai số lớn nhất thường không nằm ở “công thức môi trường” mà nằm ở chất lượng giống và thời điểm chuyển giống. Một seed culture quá già, đã bắt đầu stress hoặc tạo bào tử, sẽ làm toàn bộ mẻ lên men chính lệch động học ngay từ đầu.

4. Chọn chủng Bacillus subtilis: nền tảng của toàn bộ quy trình

Chủng giống quyết định giới hạn sinh học của quy trình. Công nghệ lên men có thể tối ưu hiệu suất, nhưng không thể biến một chủng yếu thành chủng sản xuất tốt nếu nền di truyền và đặc tính sinh lý không phù hợp.

Một chủng dùng cho sản xuất nên được đánh giá theo các nhóm tiêu chí sau.

4.1. Định danh chính xác

Không nên chỉ dựa vào hình thái khuẩn lạc, nhuộm Gram hoặc quan sát bào tử để kết luận là Bacillus subtilis. Nhóm Bacillus có nhiều loài gần nhau, trong đó có những loài không phù hợp cho thực phẩm hoặc có nguy cơ sinh độc tố.

Tối thiểu cần định danh bằng 16S rRNA kết hợp đặc điểm sinh hóa. Với sản phẩm thương mại, đặc biệt là probiotics, thức ăn chăn nuôi hoặc thực phẩm, nên định danh bằng giải trình tự toàn hệ gen để xác nhận đến cấp độ chủng, kiểm tra gen độc tố, gen kháng kháng sinh mắc phải và các yếu tố di truyền không mong muốn. Một số nghiên cứu an toàn trên chủng B. subtilis dùng cho thực phẩm và thực phẩm bổ sung cũng nhấn mạnh vai trò của giải trình tự hệ gen và đánh giá an toàn kiểu gen – kiểu hình.

4.2. Đặc tính tăng trưởng

Chủng tốt cần sinh trưởng ổn định trong môi trường có chi phí phù hợp. Trong sản xuất, môi trường quá đắt sẽ khó thương mại hóa dù kết quả phòng thí nghiệm đẹp.

Các thông số cần khảo sát gồm tốc độ sinh trưởng, mật độ cực đại, khả năng dùng nguồn carbon rẻ, khả năng chịu pH, chịu muối, chịu nhiệt, khả năng chống nhiễm tạp tương đối và mức độ tạo bọt.

4.3. Năng lực tạo bào tử hoặc không tạo bào tử

Nếu sản phẩm là bột bào tử, cần chọn chủng có tỷ lệ tạo bào tử cao, bào tử bền, hồi hoạt tốt. Nếu sản phẩm là dung dịch tế bào sinh dưỡng, cần chủng ít tạo bào tử trong điều kiện dinh dưỡng đầy đủ và có thể duy trì hoạt tính sinh học sau phối trộn.

Đây là điểm cần quyết định từ đầu. Không nên dùng cùng một quy trình cho cả sản phẩm dạng bào tử và sản phẩm không bào tử.

4.4. Tính an toàn

Với ứng dụng thực phẩm, thức ăn chăn nuôi hoặc probiotic, cần kiểm tra độc tính, gen kháng kháng sinh, hoạt tính tan máu, khả năng sinh enterotoxin hoặc các yếu tố nguy cơ khác. FDA có các hồ sơ GRAS cho một số chủng Bacillus subtilis cụ thể dùng trong thực phẩm, nhưng điều này không có nghĩa mọi chủng B. subtilis đều tự động an toàn cho mọi mục đích.

5. Bảo quản và hoạt hóa giống

Bảo quản giống là khâu tưởng nhỏ nhưng ảnh hưởng lớn đến độ ổn định mẻ lên men. Chủng giống nên được lưu dưới dạng master cell bank và working cell bank. Tùy điều kiện phòng thí nghiệm, có thể bảo quản bằng đông sâu với glycerol, đông khô hoặc phương pháp phù hợp khác.

Khi hoạt hóa giống, mục tiêu là đưa tế bào từ trạng thái bảo quản trở lại trạng thái sinh trưởng khỏe. Không nên cấy trực tiếp từ ống bảo quản vào nồi lên men chính. Cần qua bước hoạt hóa trên môi trường thích hợp, sau đó kiểm tra độ thuần và chuyển sang nhân giống cấp 1.

Ở giai đoạn này, cần tránh hai lỗi:

• Lỗi thứ nhất là hoạt hóa quá ngắn. Tế bào chưa phục hồi hoàn toàn, khi đưa vào môi trường nhân giống sẽ có pha lag dài, làm lệch thời gian lên men.
• Lỗi thứ hai là hoạt hóa quá lâu. Tế bào đi vào pha già, tích lũy stress, giảm hoạt lực hoặc bắt đầu hình thành bào tử. Khi đó, dù nhìn môi trường đục và tưởng là “giống mạnh”, thực tế chất lượng seed đã giảm.

Với Bacillus subtilis, giống dùng để cấy chuyền nên ở trạng thái sinh trưởng tích cực, thường là pha log hoặc cuối pha log sớm, tùy mục tiêu quy trình.

6. Thiết kế môi trường lên men Bacillus subtilis

Môi trường là “ngôn ngữ dinh dưỡng” mà người làm lên men dùng để điều khiển vi khuẩn. Với B. subtilis, môi trường không chỉ quyết định sinh khối mà còn ảnh hưởng đến tiết enzyme, tạo bào tử, tạo bọt, pH và chi phí sản xuất.

6.1. Nguồn carbon

Nguồn carbon thường dùng gồm glucose, sucrose, maltose, tinh bột thủy phân, mật rỉ đường, dịch thủy phân tinh bột hoặc các phụ phẩm giàu carbohydrate.

Glucose giúp tăng trưởng nhanh, nhưng nếu dùng quá nhiều có thể gây hiệu ứng ức chế dị hóa, thay đổi pH và làm lệch biểu hiện enzyme ở một số chủng. Trong quy trình tạo bào tử, carbon quá dư thường làm chậm hoặc giảm tạo bào tử. Trong quy trình không bào tử, duy trì carbon vừa đủ lại giúp giữ tế bào ở trạng thái sinh dưỡng lâu hơn.

6.2. Nguồn nitơ

Nguồn nitơ có thể là peptone, yeast extract, tryptone, cao ngô, bột đậu nành thủy phân, ammonium sulfate hoặc các nguồn nitơ hữu cơ – vô cơ khác.

Nitơ hữu cơ thường giúp tăng trưởng và tiết enzyme tốt hơn, nhưng chi phí cao. Nguồn nitơ công nghiệp rẻ hơn cần được chuẩn hóa vì thành phần dao động theo lô nguyên liệu.

Tỷ lệ C/N là thông số rất quan trọng. C/N cao có thể tạo dư carbon và thay đổi pH; C/N thấp có thể giới hạn tăng trưởng. Với sản xuất bào tử, giai đoạn đầu cần đủ C/N để tạo sinh khối, giai đoạn sau cần tín hiệu giới hạn dinh dưỡng để chuyển sang sporulation.

6.3. Khoáng và vi lượng

Các muối phosphate, magnesium, calcium, manganese, iron và các nguyên tố vi lượng khác ảnh hưởng đến tăng trưởng, enzyme và tạo bào tử. Manganese thường được nhắc đến trong nhiều môi trường tạo bào tử của Bacillus, nhưng nồng độ tối ưu phụ thuộc chủng và mục tiêu.

Phosphate vừa là chất dinh dưỡng vừa là hệ đệm pH. Tuy nhiên, phosphate quá cao có thể ảnh hưởng đến một số tuyến chuyển hóa hoặc tạo kết tủa với ion kim loại.

6.4. Chất cảm ứng hoặc cơ chất đặc hiệu

Nếu mục tiêu là enzyme, môi trường có thể bổ sung cơ chất cảm ứng. Ví dụ, tinh bột hoặc dextrin cho amylase, protein hoặc casein cho protease, xylan cho xylanase. Nhưng cần nhớ: cơ chất cảm ứng không chỉ làm tăng enzyme, nó cũng có thể làm tăng độ nhớt, tăng bọt hoặc gây khó lọc sau lên men.

6.5. Chống tạo bọt

Bacillus subtilis có thể tạo bọt mạnh do sinh enzyme, peptide bề mặt, protein ngoại bào và sục khí cao. Trong nồi lên men, bọt không chỉ gây trào mẻ mà còn làm tăng nguy cơ nhiễm tạp qua đường lọc khí hoặc van.

Có thể dùng chất phá bọt phù hợp với mục đích sản phẩm. Tuy nhiên, chất phá bọt cũng có thể ảnh hưởng đến truyền oxy và quy trình thu hồi sau này. Đây là điểm cần tối ưu thực nghiệm chứ không nên dùng tùy tiện.

7. Điều kiện vận hành lên men chính

7.1. Nhiệt độ

Nhiều chủng Bacillus subtilis sinh trưởng tốt quanh vùng 30–37°C. Tuy nhiên, nhiệt độ tối ưu cho sinh khối, enzyme và bào tử có thể khác nhau. Nhiệt độ cao hơn có thể rút ngắn thời gian tăng trưởng nhưng cũng làm tăng stress, thay đổi tiết enzyme và tăng nguy cơ suy giảm tế bào ở cuối mẻ.

Với sản xuất enzyme, đôi khi nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ sinh trưởng tối ưu lại giúp protein ổn định hơn. Với sản xuất bào tử, nhiệt độ cần đủ để tế bào phát triển nhưng không gây stress cực đoan.

7.2. pH

pH ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt động enzyme, vận chuyển dinh dưỡng, trạng thái màng tế bào và khả năng tạo bào tử. B. subtilis thường được nuôi ở pH gần trung tính. Trong lên men công nghiệp, pH có thể thay đổi do tiêu thụ đường, tạo acid hữu cơ, sử dụng nguồn nitơ hoặc giải phóng ammonium.

Nếu không kiểm soát pH, mẻ lên men có thể đi theo hướng không mong muốn: tế bào chậm tăng trưởng, enzyme giảm hoạt tính hoặc tạo bào tử sớm. Với quy mô nhỏ, có thể dùng hệ đệm. Với bioreactor, nên kiểm soát pH tự động bằng acid/base phù hợp.

7.3. Oxy hòa tan

Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí, do đó oxy hòa tan là thông số cốt lõi. Thiếu oxy có thể làm giảm tăng trưởng, thay đổi chuyển hóa, tăng sản phẩm phụ và làm quy trình thiếu ổn định.

Trong nồi lên men, oxy hòa tan phụ thuộc vào tốc độ sục khí, tốc độ khuấy, thiết kế cánh khuấy, độ nhớt môi trường, bọt và áp suất. Không nên chỉ nói “khuấy 300 rpm” hay “sục khí 1 vvm” mà xem đó là điều kiện chuẩn cho mọi nồi. Cùng một rpm, hiệu quả truyền oxy ở nồi 5 L và 500 L có thể khác hoàn toàn.

7.4. Tốc độ khuấy

Khuấy giúp phân tán oxy, đồng nhất nhiệt, pH và dinh dưỡng. Nhưng khuấy quá mạnh có thể tăng bọt, tăng lực cắt và làm biến tính một số protein ngoại bào.

Với Bacillus subtilis, lực cắt thường không nhạy như tế bào động vật, nhưng ở quy mô công nghiệp, bọt và truyền oxy vẫn là vấn đề cần tính toán.

7.5. Thời gian lên men

Thời gian lên men phải gắn với mục tiêu sản phẩm:

• Nếu thu tế bào sinh dưỡng không bào tử, nên thu ở cuối pha log hoặc đầu pha ổn định, trước khi tín hiệu thiếu dinh dưỡng kích hoạt mạnh.
• Nếu thu enzyme, nên theo dõi hoạt tính enzyme theo thời gian và xác định thời điểm đạt đỉnh. Không nên mặc định thu khi OD cao nhất.
• Nếu thu bào tử, cần kéo dài giai đoạn sau tăng trưởng để tế bào hoàn tất quá trình tạo bào tử, sau đó kiểm tra tỷ lệ bào tử bằng nhuộm bào tử, xử lý nhiệt chọn lọc hoặc phương pháp định lượng phù hợp.

8. Kiểm soát tạo bào tử trong lên men Bacillus subtilis

Đây là phần quan trọng nhất của bài viết, vì tạo bào tử vừa là lợi thế vừa là rủi ro quy trình.

8.1. Khi nào Bacillus subtilis tạo bào tử?

Bacillus subtilis thường khởi động tạo bào tử khi môi trường trở nên bất lợi, đặc biệt là khi dinh dưỡng giới hạn. Tín hiệu này được tích hợp qua các hệ thống điều hòa, trong đó Spo0A phosphoryl hóa là yếu tố trung tâm quyết định bước vào chương trình tạo bào tử. Khi Spo0A được hoạt hóa đến ngưỡng phù hợp, tế bào bắt đầu phân chia bất đối xứng, hình thành tiền bào tử và tế bào mẹ, sau đó hoàn thiện lớp vỏ bào tử.

Nói đơn giản hơn, tế bào sinh dưỡng là trạng thái “tăng trưởng”, còn bào tử là trạng thái “sống sót”. Khi môi trường còn giàu dinh dưỡng, vi khuẩn ưu tiên tăng sinh. Khi môi trường thiếu hụt và mật độ tế bào cao, vi khuẩn bắt đầu đầu tư năng lượng vào cấu trúc bền vững hơn.

8.2. Muốn tạo bào tử cao cần làm gì?

Muốn tạo bào tử tốt, quy trình nên đi theo hai pha.

• Pha đầu là pha tạo sinh khối: Ở pha này, môi trường cần đủ dinh dưỡng, oxy tốt, pH phù hợp để tế bào đạt mật độ cao.
• Pha hai là pha cảm ứng tạo bào tử: Ở pha này, nguồn dinh dưỡng, đặc biệt là carbon, nitơ hoặc phosphate, được giới hạn có kiểm soát. Đồng thời cần duy trì điều kiện không làm tế bào chết hàng loạt. Đây là nghệ thuật của quy trình tạo bào tử: tạo stress đủ để kích hoạt sporulation, nhưng không quá mạnh để phá hỏng mẻ.

Các yếu tố thường ảnh hưởng đến tỷ lệ bào tử gồm chủng giống, tuổi giống, tỷ lệ cấy, nguồn carbon, nguồn nitơ, mangan, phosphate, oxy hòa tan, pH, nhiệt độ, thời gian sau pha tăng trưởng và mật độ tế bào.

8.3. Muốn hạn chế bào tử cần làm gì?

Ngược lại, nếu muốn sản xuất nguyên liệu Bacillus subtilis không bào tử hoặc ít bào tử cho chế phẩm dạng dung dịch, cần giữ tế bào trong điều kiện sinh dưỡng.

Các nguyên tắc chính gồm:

• Duy trì dinh dưỡng không để cạn đột ngột. Carbon và nitơ không nên rơi vào trạng thái giới hạn nghiêm trọng trước khi thu hoạch.
• Thu hoạch sớm. Đây là cách thực tế nhất. Không nên kéo dài mẻ quá sâu vào pha ổn định.
• Kiểm soát oxy hòa tan. Thiếu oxy có thể gây stress chuyển hóa và làm quy trình khó dự đoán.
• Tránh pH lệch mạnh. pH acid hoặc kiềm quá mức đều có thể tạo stress.
• Dùng seed trẻ. Giống già hoặc đã có tỷ lệ bào tử cao sẽ kéo theo tỷ lệ bào tử trong mẻ chính.
• Theo dõi tỷ lệ bào tử theo thời gian. Không thể kiểm soát thứ mình không đo. Nên kiểm tra mẫu ở các mốc lên men để xác định thời điểm bào tử bắt đầu tăng.

Về quan điểm kỹ thuật, nếu sản phẩm là men vi sinh dạng dung dịch chứa tế bào sinh dưỡng, tôi ưu tiên chiến lược “thu sớm, ổn định nhanh, bảo quản lạnh hoặc nền ổn định phù hợp” hơn là cố kéo dài lên men để tăng thêm OD. Tăng thêm một ít sinh khối nhưng làm tế bào stress, giảm sống sót sau phối trộn thì không đáng.

9. Quy trình lên men tạo sinh khối Bacillus subtilis dạng không bào tử

Quy trình này phù hợp khi cần nguyên liệu tế bào sống để phối trộn vào sản phẩm dạng nước, chế phẩm xử lý môi trường dạng dung dịch hoặc sản phẩm cần hoạt tính trao đổi chất nhanh.

9.1. Mục tiêu kỹ thuật

Mục tiêu là tạo mật độ tế bào sống cao, tỷ lệ tế bào sinh dưỡng cao, tỷ lệ bào tử thấp, độ nhiễm tạp bằng 0 hoặc trong giới hạn cho phép, tế bào giữ được hoạt lực sau phối trộn.

9.2. Chiến lược quy trình

Giai đoạn giống cần dùng culture trẻ. Môi trường lên men cần đủ carbon, nitơ, khoáng và yếu tố sinh trưởng. pH nên giữ gần trung tính. Oxy hòa tan cần đủ cho sinh trưởng hiếu khí. Thu hoạch nên thực hiện trước khi môi trường cạn dinh dưỡng rõ rệt.

Sau thu hoạch, sinh khối có thể được tách bằng ly tâm hoặc dùng trực tiếp dạng dịch lên men nếu sản phẩm cho phép. Nếu phối trộn vào dung dịch thành phẩm, cần cân nhắc áp suất thẩm thấu, pH nền, chất bảo quản, đường, muối, chất ổn định và tương tác với các chủng vi sinh khác.

9.3. Điểm kiểm soát quan trọng

Điểm kiểm soát đầu tiên là tuổi giống. Seed quá già sẽ làm tỷ lệ bào tử tăng.

Điểm thứ hai là thời điểm thu hoạch. Cần xây dựng đường cong tăng trưởng, CFU và tỷ lệ bào tử theo từng giờ để chọn điểm thu.

Điểm thứ ba là nền dung dịch sau phối trộn. Nhiều công thức dung dịch “giết” tế bào không phải vì lên men sai, mà vì pH, chất bảo quản, hương liệu, áp suất thẩm thấu hoặc chất hoạt động bề mặt không phù hợp.

Điểm thứ tư là bảo quản. Tế bào sinh dưỡng của Bacillus subtilis không bền như bào tử. Nếu muốn sản phẩm dạng dung dịch có hạn dùng dài ở nhiệt độ phòng, cần nghiên cứu ổn định rất kỹ. Trong nhiều trường hợp, dùng bào tử vẫn thực tế hơn. Nhưng nếu mục tiêu là hoạt tính nhanh sau sử dụng, tế bào sinh dưỡng có lý do riêng để được lựa chọn.

10. Quy trình lên men tạo bào tử Bacillus subtilis

Với sản phẩm dạng bột, dạng cốm, chế phẩm nông nghiệp, chế phẩm xử lý nước thải hoặc ao nuôi, bào tử thường là dạng nguyên liệu được ưu tiên.

10.1. Mục tiêu kỹ thuật

Mục tiêu không chỉ là CFU cao, mà là CFU bền. Cần tỷ lệ bào tử cao, khả năng hồi hoạt tốt, chịu sấy tốt, ổn định trong bảo quản và không nhiễm tạp.

10.2. Chiến lược hai pha

Ở pha đầu, tạo sinh khối khỏe. Ở pha sau, chuyển sang điều kiện kích thích tạo bào tử bằng giới hạn dinh dưỡng có kiểm soát. Sau đó, tiếp tục duy trì điều kiện đủ oxy và pH phù hợp để bào tử hoàn thiện.

Nếu thu quá sớm, nhiều tế bào mới ở giai đoạn tiền bào tử, chưa có độ bền mong muốn.

Nếu thu quá muộn, môi trường có thể tích lũy sản phẩm phân giải, enzyme protease hoặc tạp chất làm giảm chất lượng.

10.3. Kiểm tra tỷ lệ bào tử

Có thể dùng kính hiển vi sau nhuộm bào tử để đánh giá hình thái. Có thể định lượng CFU trước và sau xử lý nhiệt chọn lọc để ước tính tỷ lệ bào tử sống. Ngoài ra, cần kiểm tra độ ẩm nếu sản phẩm được sấy, khả năng hồi hoạt sau bảo quản và độ ổn định theo thời gian.

11. Thu hồi sau lên men

Sau lên men, hướng xử lý phụ thuộc vào sản phẩm.

11.1. Thu dịch enzyme

Nếu mục tiêu là enzyme ngoại bào, cần loại tế bào bằng ly tâm, lọc hoặc vi lọc. Dịch trong sau đó có thể được cô đặc, kết tủa, tinh sạch một phần hoặc phối trộn trực tiếp tùy yêu cầu.

Cần kiểm tra hoạt tính enzyme, protein tổng, pH, độ ổn định nhiệt, độ ổn định bảo quản và tạp nhiễm.

11.2. Thu sinh khối tế bào sống

Nếu mục tiêu là tế bào sống, có thể dùng ly tâm để cô đặc sinh khối. Sinh khối sau đó được tái huyền phù trong đệm, nước vô trùng, nền dinh dưỡng nhẹ hoặc chất bảo vệ phù hợp. Với tế bào không bào tử, quy trình sau thu hoạch phải nhanh và nhẹ. Thời gian giữ sinh khối ẩm quá lâu ở nhiệt độ không phù hợp có thể làm giảm sống sót đáng kể.

11.3. Thu bào tử

Nếu mục tiêu là bào tử, sinh khối có thể được thu, rửa để loại bỏ thành phần môi trường, sau đó phối với chất mang và sấy. Chất mang thường cần tương thích với bào tử, không hút ẩm quá mạnh, không gây chết khi sấy và phù hợp ứng dụng cuối.

Các phương pháp sấy có thể gồm sấy phun, sấy tầng sôi, sấy lạnh hoặc đông khô. Mỗi phương pháp có chi phí và mức độ ảnh hưởng đến CFU khác nhau.

12. Kiểm nghiệm chất lượng nguyên liệu Bacillus subtilis

Một nguyên liệu Bacillus subtilis đạt yêu cầu không thể chỉ dựa vào mùi lên men dễ chịu hoặc độ đục cao. Cần có hệ thống kiểm nghiệm.

Các chỉ tiêu thường gồm:

• Định danh chủng: xác nhận đúng chủng sản xuất.
• Độ thuần: không lẫn vi khuẩn khác, nấm men, nấm mốc hoặc tác nhân không mong muốn. CFU/mL hoặc CFU/g: xác định số tế bào sống.
• Tỷ lệ bào tử: đặc biệt quan trọng nếu sản phẩm yêu cầu bào tử cao hoặc không bào tử.
• Hoạt tính enzyme: nếu sản phẩm công bố enzyme.
• Độ ẩm: với sản phẩm bột. pH: với sản phẩm lỏng.
• Độ ổn định: theo dõi CFU sau bảo quản tăng tốc và bảo quản thực.
• An toàn vi sinh: tùy ứng dụng, có thể cần kiểm tra E. coli, Salmonella, Staphylococcus aureus, coliform, tổng nấm men nấm mốc hoặc các chỉ tiêu theo tiêu chuẩn liên quan.
• Kháng kháng sinh và độc tố: với sản phẩm dùng cho người hoặc vật nuôi, đây là nhóm chỉ tiêu không nên bỏ qua. Các tổng quan về probiotic Bacillus cũng lưu ý rằng bên cạnh tiềm năng ứng dụng, một số chủng Bacillus có thể liên quan đến nguy cơ độc tố, amine sinh học hoặc gen kháng kháng sinh, do đó đánh giá an toàn đến cấp độ chủng là cần thiết.

13. Các lỗi thường gặp trong lên men Bacillus subtilis

13.1. Dùng giống không ổn định

Giống chuyền quá nhiều đời, bảo quản không chuẩn hoặc không có cell bank sẽ dễ biến đổi đặc tính. Có thể mất khả năng tiết enzyme, thay đổi tỷ lệ bào tử hoặc giảm tốc độ sinh trưởng.

13.2. Không kiểm soát tuổi seed

Seed già là nguyên nhân phổ biến làm mẻ lên men dao động. Với Bacillus subtilis, seed già còn có nguy cơ tăng tỷ lệ bào tử ngay từ đầu.

13.3. Chỉ tối ưu OD mà quên mục tiêu thật

OD cao không đồng nghĩa với CFU cao. CFU cao không đồng nghĩa với enzyme cao. Bào tử cao không đồng nghĩa với hồi hoạt tốt. Mỗi sản phẩm phải có chỉ tiêu chính.

13.4. Không kiểm soát oxy

Với vi khuẩn hiếu khí, thiếu oxy làm quy trình mất ổn định. Ở bình lắc, vấn đề thường là tỷ lệ thể tích môi trường quá cao. Ở nồi lên men, vấn đề thường là khuấy, sục khí, bọt và độ nhớt.

13.5. Thu hoạch sai thời điểm

Thu sớm quá thì sinh khối chưa đạt. Thu muộn quá thì tế bào chết, enzyme bị phân giải hoặc bào tử tăng ngoài ý muốn. Cách tốt nhất là xây dựng đường cong động học cho từng chủng và từng môi trường.

13.6. Không đánh giá độ ổn định sau phối trộn

Nhiều mẻ lên men đạt CFU cao nhưng thành phẩm lại giảm nhanh sau vài tuần. Nguyên nhân nằm ở nền công thức, chất bảo quản, pH, nhiệt độ bảo quản, oxy hòa tan trong chai hoặc tương tác giữa các chủng.

14. Lên men Bacillus subtilis cho từng nhóm sản phẩm

14.1. Chế phẩm men vi sinh dạng dung dịch

Nên ưu tiên tế bào sinh dưỡng nếu cần tác dụng nhanh, nhưng phải chấp nhận thách thức về ổn định. Công thức nền cần nhẹ, không có chất ức chế, pH phù hợp và bảo quản trong điều kiện được kiểm soát.

Nếu muốn hạn dùng dài ở nhiệt độ phòng, nên cân nhắc dùng bào tử hoặc phối hợp giữa bào tử và một tỷ lệ tế bào sinh dưỡng tùy định hướng sản phẩm.

14.2. Chế phẩm bột probiotic

Nên ưu tiên bào tử vì độ bền cao hơn. Quy trình cần tối ưu tỷ lệ bào tử, khả năng sống sau sấy và khả năng hồi hoạt trong điều kiện sử dụng.

14.3. Phân bón vi sinh và chế phẩm nông nghiệp

Cần quan tâm khả năng sống trên chất mang, cạnh tranh vùng rễ, tiết chất đối kháng, tạo biofilm và tương thích với phân hữu cơ, acid humic, khoáng hoặc các chủng vi sinh khác.

14.4. Chế phẩm xử lý môi trường, ao nuôi, nước thải

Cần chọn chủng có khả năng tiết enzyme phân giải hữu cơ, chịu pH và độ mặn phù hợp. Bào tử thường có lợi vì điều kiện môi trường sử dụng không ổn định.

14.5. Sản xuất enzyme công nghiệp

Cần tối ưu riêng theo enzyme mục tiêu. Không nên lấy quy trình tạo sinh khối hoặc tạo bào tử để áp cho sản xuất enzyme. Với enzyme ngoại bào, cần kiểm soát cả enzyme mong muốn và protease không mong muốn.

15. Quy trình R&D đề xuất để tối ưu lên men Bacillus subtilis

Một chương trình R&D bài bản nên đi theo các bước sau.

• Bước 1: Sàng lọc chủng. Đánh giá tăng trưởng, enzyme, đối kháng, tạo bào tử và an toàn sơ bộ.
• Bước 2: Chọn 2–3 môi trường nền. Không nên tối ưu ngay quá nhiều biến. Hãy chọn môi trường giàu, môi trường bán công nghiệp và môi trường chi phí thấp.
• Bước 3: Xây dựng đường cong tăng trưởng. Theo dõi OD, CFU, pH, bào tử và hoạt tính mục tiêu theo thời gian.
• Bước 4: Tối ưu nguồn carbon và nitơ. Dùng thiết kế thí nghiệm nếu có điều kiện.
• Bước 5: Tối ưu pH, nhiệt độ, sục khí và khuấy.
• Bước 6: Tối ưu thời điểm thu hoạch.
• Bước 7: Kiểm tra sau thu hoạch: ly tâm, tái huyền phù, sấy, phối trộn, bảo quản.
• Bước 8: Chạy pilot. Đây là bước bắt buộc vì bình lắc không phản ánh đầy đủ truyền oxy, bọt và động học của nồi lên men.
• Bước 9: Đánh giá ổn định thành phẩm. Theo dõi CFU, hoạt tính, pH, cảm quan và nhiễm tạp theo thời gian.
• Bước 10: Chuẩn hóa SOP và tiêu chuẩn cơ sở.

Trong thực tế, R&D lên men thất bại nhiều nhất ở bước scale-up. Một công thức chạy tốt ở bình tam giác 250 mL chưa chắc chạy tốt ở nồi 100 L. Nguyên nhân thường là truyền oxy, bọt, pH và thời điểm chuyển pha.

Câu hỏi thường gặp về quy trình lên men Bacillus subtilis

1. Lên men Bacillus subtilis mất bao lâu?

Tùy mục tiêu. Nếu thu tế bào sinh dưỡng, thời gian thường ngắn hơn và cần thu trước khi bào tử tăng mạnh. Nếu tạo bào tử, thời gian cần kéo dài hơn để bào tử hoàn thiện. Nếu sản xuất enzyme, thời điểm thu phụ thuộc vào lúc hoạt tính enzyme đạt đỉnh.

2. Bacillus subtilis có bắt buộc phải tạo bào tử không?

Không. Trong điều kiện dinh dưỡng đầy đủ và thu hoạch sớm, tế bào có thể chủ yếu ở dạng sinh dưỡng. Tuy nhiên, khi môi trường thiếu dinh dưỡng hoặc tế bào đi vào pha ổn định lâu, quá trình tạo bào tử có thể được kích hoạt.

3. Dạng bào tử hay dạng tế bào sinh dưỡng tốt hơn?

Không có dạng nào luôn tốt hơn. Bào tử bền hơn, phù hợp sản phẩm cần bảo quản dài ngày. Tế bào sinh dưỡng có thể hoạt động nhanh hơn nhưng khó ổn định hơn, nhất là trong sản phẩm dạng dung dịch.

4. Vì sao mẻ lên men có CFU cao nhưng thành phẩm nhanh giảm?

Nguyên nhân thường nằm ở stress sau thu hoạch, nền phối trộn không phù hợp, pH bất lợi, chất bảo quản ức chế vi khuẩn, nhiệt độ bảo quản cao hoặc tế bào đã già trước khi thu hoạch.

5. Có thể dùng cùng một quy trình cho sản phẩm enzyme và sản phẩm bào tử không?

Không nên. Sản xuất enzyme, sinh khối và bào tử là ba mục tiêu khác nhau. Mỗi mục tiêu cần điều kiện môi trường, thời điểm thu hoạch và chỉ tiêu kiểm nghiệm riêng.

6. Làm sao biết Bacillus subtilis đã tạo bào tử?

Có thể quan sát bằng kính hiển vi sau nhuộm bào tử, kiểm tra hình thái bào tử, hoặc so sánh CFU trước và sau xử lý nhiệt chọn lọc. Với sản xuất, nên kết hợp nhiều phương pháp để đánh giá chính xác.

7. Bacillus subtilis có an toàn không?

Nhiều chủng Bacillus subtilis được ứng dụng trong thực phẩm, probiotic, enzyme và nông nghiệp. Tuy nhiên, an toàn phải được đánh giá ở cấp độ chủng, không nên suy luận chỉ từ tên loài. Cần kiểm tra định danh, độc tố, kháng kháng sinh mắc phải và tiêu chuẩn vi sinh phù hợp với mục đích sử dụng. EFSA cũng yêu cầu các điều kiện như xác nhận định danh, không có gen kháng kháng sinh mắc phải có ý nghĩa và không có tiềm năng sinh độc tố đối với các loài Bacillus trong đánh giá QPS.

Kết luận

Quy trình lên men Bacillus subtilis không phải là một công thức cố định. Đó là một hệ thống điều khiển sinh lý vi khuẩn theo mục tiêu sản phẩm.

Nếu cần sinh khối không bào tử cho chế phẩm dạng dung dịch, cần giữ tế bào ở trạng thái sinh dưỡng, dùng giống trẻ, dinh dưỡng đầy đủ, oxy phù hợp và thu hoạch sớm.

Nếu cần bào tử, cần tạo sinh khối khỏe trước, sau đó kích hoạt tạo bào tử bằng giới hạn dinh dưỡng có kiểm soát, đồng thời theo dõi tỷ lệ bào tử và khả năng hồi hoạt.

Nếu cần enzyme, cần tối ưu theo hoạt tính enzyme chứ không chỉ theo mật độ tế bào. Nếu cần chế phẩm nông nghiệp hoặc xử lý môi trường, cần đánh giá thêm khả năng sống sót trên chất mang, đối kháng sinh học, chịu điều kiện thực địa và độ ổn định sau bảo quản.

Điểm mấu chốt là phải xem Bacillus subtilis như một hệ sinh học có trạng thái chuyển pha rõ ràng: sinh trưởng, tiết enzyme, tạo chất chuyển hóa, tạo màng sinh học và tạo bào tử. Người làm lên men giỏi là người biết điều khiển các trạng thái đó theo mục tiêu sản phẩm, thay vì chỉ cố làm cho môi trường “đục nhanh” hoặc CFU “cao nhất”.

Xem thêm:

• Bacillus subtilis là gì? Đặc điểm sinh học, bào tử và ứng dụng trong công nghệ vi sinh
• Môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis: nguồn carbon, nitơ, khoáng và chất cảm ứng enzyme
• Điều kiện lên men Bacillus subtilis: pH, nhiệt độ, oxy hòa tan, khuấy và sục khí
• Quy trình lên men Bacillus subtilis tạo bào tử cho chế phẩm vi sinh dạng bột
• Quy trình lên men Bacillus subtilis không bào tử cho men vi sinh dạng dung dịch
• Cách kiểm tra CFU, tỷ lệ bào tử và độ thuần của nguyên liệu Bacillus subtilis
• Sản xuất enzyme từ Bacillus subtilis: protease, amylase, cellulase và xylanase
• Ứng dụng Bacillus subtilis trong phân bón vi sinh và thuốc bảo vệ thực vật sinh học
• Các lỗi thường gặp khi scale-up lên men Bacillus subtilis từ phòng thí nghiệm lên pilot
• Tiêu chuẩn an toàn của chủng Bacillus subtilis dùng trong probiotic, thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

Tài liệu tham khảo

• Microb Cell Fact. 2020 Sep 3;19:173. doi: 10.1186/s12934-020-01436-8
• Saudi J Biol Sci. 2019 May 20;26(6):1291–1297. doi: 10.1016/j.sjbs.2019.05.004
• EFSA – Qualified presumption of safety (QPS)
• Microbiol Rev. 1993 Mar;57(1):1–33. doi: 10.1128/mr.57.1.1-33.1993
• Nutrients. 2021 Feb 25;13(3):733. doi: 10.3390/nu13030733
• GRN No. 1143 Bacillus subtilis NRRL 68053
• FEMS Microbiol Rev. 2011 Oct 25;36(1):131–148. doi: 10.1111/j.1574-6976.2011.00310.x
• Food Sci Biotechnol. 2019 Oct 8;28(5):1297–1305. doi: 10.1007/s10068-019-00691-9